Los promotores de estrés oxidativo son aquellas moléculas capaces de producir alteración en el equilibrio redox a nivel celular o humoral. Entre las principales ERO se encuentran: el anión radical superóxido (O2•-), el radical hidroxilo (•OH), el óxido nítrico (•NO), el radical dióxido de nitrógeno (•NO2), el anión peroxinitrito (ONOO-), el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el oxígeno singlete (1O2), entre otras. Estas sustancias se generan a tres niveles: a) en la mitocondria, que es la mayor fuente de producción de ERO a través de la formación de ATP en la cadena respiratoria; b) durante una reacción inflamatoria o infecciosa, los fagocitos activados utilizan la generación de diferentes ERO para la destrucción del contenido del fagosoma, y c) en los eritrocitos, debido a la elevada tensión de oxígeno en la sangre arterial y al hierro contenido en el grupo hemo de la hemoglobina, continuamente se producen ERO.
Este trabajo estuvo dirigido a estudiar las variaciones en la producción de radicales libres ERO generadas por la presencia de antibióticos con características muy diferentes en cuanto a sus estructuras químicas, sus mecanismos de acción, sus espectros antimicrobianos y sus grados de toxicidad, como son la gentamicina sulfato (GS), la ampicilina sódica (AS) y el cloranfenicol como sal succinato sódico (ChS) y como base (ChB) en modelos in vitro e in vivo.
Además, se investigó la oxidación de biomoléculas intra- y extracelulares tales como lípidos, proteínas, carbohidratos y ácidos nucleicos (biomarcadores de estrés oxidativo), que evidenciaron la acción oxidante de las especies radicalarias.
Para completar el perfil oxidativo, se estudiaron las defensas antioxidantes presentes en el plasma, encargadas de tratar de contrarrestar cualquier desbalance oxidativo. En condiciones normales, la concentración de antioxidantes es bastante superior a la de productos oxidantes, de manera que la generación continua de radicales libres, derivados del metabolismo celular, queda regulada y neutralizada por ellas. Una protección antioxidante eficaz requiere la actuación sincronizada de las defensas antioxidantes enzimáticas, como la superóxido dismutasa (SOD), la catalasa y el glutatión peroxidasa (GPx), y no enzimáticas, como el glutatión (GSH) y las vitaminas C y E, entre otras.
La ruptura del equilibrio prooxidativo-antioxidante lleva al estrés oxidativo. Los efectos tóxicos de estos radicales sobre las principales biomoléculas en el interior de la célula conducen, en un primer momento, a un daño celular reversible, pudiendo provocar daño irreversible e incluso la muerte celular si el estrés oxidativo persiste.
Complementando los estudios a nivel molecular de promotores, biomarcadores y defensas, se avanzó sobre las consecuencias celulares en la médula ósea de ratas Wistar.
Mediante la puesta a punto de una técnica cinética de quimioluminiscencia amplificada por luminol, fue posible detectar la producción de radicales libres en presencia de dichos antibióticos, utilizando como muestra pequeños volúmenes de sangre entera. Se observaron diferencias en la capacidad de producción de radicales libres, tanto frente a buffer como frente a los antibióticos, en una población de más de un centenar de personas, posiblemente debido a factores intrínsecos y extrínsecos de cada individuo, entre los cuales pueden mencionarse factores genéticos, hábitos de vida, condiciones ambientales y uso de medicamentos; la variabilidad también se asocia con la diferencia de respuesta y susceptibilidad a la terapia con medicamentos.
El ChS en concentración terapéutica provocó niveles de estrés comparables a los obtenidos con un reconocido estimulante de radicales libres como es el forbol miristato (PMA). Con este antibiótico se observó un aumento en la capacidad de producción de radicales libres en mujeres embarazadas y una franca caída en los niveles de ERO en pacientes hiperlipémicos en tratamiento con estatinas, en concordancia con los efectos antioxidantes descritos en la bibliografía para estos medicamentos. No se observaron variaciones en los niveles de ERO en diabéticos, hipotiroideos e hipertensos con el tratamiento farmacológico correspondiente respecto a la población de referencia.
Los resultados con sangre humana in vitro evidenciaron unas respuestas bifásicas a nivel de ERO, es decir, un incremento inicial seguido de una caída a mayor concentración de antibiótico. La descripción de este comportamiento hermético para la producción de radicales libres frente a concentraciones crecientes de estos antibióticos es una aportación novedosa de este trabajo de tesis, que permite explicar algunas contradicciones encontradas en la literatura científica en relación con este tema. La GS presentó el mayor poder tóxico mediado por radicales libres, provocando mayor fase de caída o segunda fase (75%) a una concentración 500 veces menor que los demás antibióticos.
En ensayos preliminares in vitro, los tres antibióticos estudiados produjeron un aumento de la eriptosis, lo que pudo contrarrestarse ante la presencia de la vitamina C; este fenómeno sólo pudo ponerse de manifiesto empleando un marcador temprano de alteraciones de membrana como la anexina V-FITC.
En un modelo animal in vivo con ratas Wistar, se reprodujo el comportamiento bifásico observado in vitro, con un incremento significativo de los productos avanzados de degradación de proteínas oxidadas (AOPP), de la enzima SOD y de FRAP frente a dosis tóxicas de GS. En la médula ósea se vio una disminución en todos los precursores mieloides, principalmente de mielocito, metamielocito y cayado, mientras que en la serie eritroide se observaron dos tipos de respuestas. Hubo una respuesta diferente a pesar de ser animales endocriados: un grupo presentó baja degradación de proteínas oxidadas a AOPP, junto con unadisminución significativa de las series roja y mieloide y una mayor caída de la producción de ERO entre el tercer y el quinto día de tratamiento, posiblemente una condición más desfavorecedora para responder a la agresión oxidativa del antibiótico; en cambio, el otro grupo presentó una reducción no significativa de las serie roja y mieloide, con una menor caída de ERO entre el tercer y el quinto día, pero con un aumento significativo de la degradación de proteínas oxidadas a AOPP en plasma. Estos resultados sugieren que los niveles de degradación de las proteínas plasmáticas oxidadas a AOPP y los valores de ERO en sangre podrían dar indicios de lo que sucede en la médula ósea por acción de los radicales libres producidos por la administración de ciertos medicamentos. La vitamina C contrarrestó el efecto provocado por la GS a nivel de ERO, AOPP, FRAP y SOD en sangre, y revirtió la alteración a nivel de las series mieloide y eritroide en la médula ósea.
Esta tesis describe aspectos nuevos de la acción de antibióticos que refuerzan la hipótesis de que éstos y otros medicamentos pueden generar desbalance en la producción de ERO, lo que ocasiona daños moleculares y celulares importantes, dependiendo del grado de toxicidad y de la respuesta antioxidante defensiva en las células sanguíneas. De este modo, la valoración de la evolución de lo que sucede en sangre podría servir para evitar que los daños lleguen a ser importantes en otros órganos como la médula ósea.
En conclusión, creemos que el trabajo presentado en esta tesis permite comprender mejor el equilibrio dinámico que se establece entre fuerzas prooxidantes y antioxidantes. En ese sentido, pensamos que podría ser utilizado para hacer un seguimiento de la terapia farmacológica (antibióticos y quimioterápicos, entre otros) mediante controles en sangre de pacientes cuya calidad de vida se vea comprometida y para intentar detectar a tiempo situaciones en las que el organismo aún posea capacidad de defenderse frente a la agresión oxidativa de los medicamentos y prevenir situaciones sin retorno.